Stage Master

Mots-clés : cryo-microscopie, assemblages multi-protéiques, biologie structurale

Contexte : L’ADN est fréquemment exposé à l’action d’évènements génotoxiques, que ce soit par des agents exogènes comme les radiations ionisantes, des molécules mutagènes ou par le métabolisme cellulaire. Différentes mécanismes cellulaires permettent l’élimination et la réparation de ces lésions. Nous travaillons sur la voie de réparation par excision-resynthèse des nucléotides (NER), plus précisément sur le facteur TFIIH, un complexe multi-protéique impliqué non seulement dans la voie NER mais également dans l’initiation de la transcription et sa régulation. Des mutations dans 3 de ses sous-unités sont à l’origine de plusieurs maladies génétiques rares et constituent une cible thérapeutique emergente pour le traitement de plusieurs cancers.

Projet : Le stage proposé se focalisera sur l’étude du complexe core-TFIIH composé de 7 sous-unités dont les protéines XPB et XPD qui possèdent respectivement des activités translocase et hélicase. TFIIH et ses composantes ont fait l’objet de nombreuses études structurales mais nous disposons encore de peu d’information sur la manière dont ce complexe s’associe avec des substrats ou avec des partenaires. Un premier volet du travail portera sur la reconstitution du complexes core-TFIIH à partir de protéines recombinantes exprimées en cellules d’insectes et sa purification. Le complexe purifié pourrait être utilisé pour étudier comment les protéines XPB et XPD interagissent avec des substrats ADN et mieux comprendre les bases moléculaires des activités translocase et hélicase de TFIIH. Des approches biochimiques, biophysiques et structurales seront combinées. Il serait également possible de se focaliser sur le partenariat avec l’endonuclease XPG pour dévoiler les bases moléculaires de l’interaction TFIIH/XPG et ainsi mieux comprendre comment ses activités catalytiques sont régulées.

Techniques: Production et purification de complexes multi-protéiques (système d’expression baculovirus). Etude de protéines/complexes par des méthodes biochimiques (gel-retard, tests ATPase et hélicase…), biophysiques (gel-filtration, diffusion de lumière, ultracentrifugation analytique, spectrométrie de masse) et initiation à la cryo-microscopie.