Stage Master

Mots-clés : Réparation de l'ADN, Transcription, complexe TFIIH Imagerie, CRISPR, Cancer

Contexte : La voie de réparation de l’ADN par excision-resynthèse de nucléotides (NER) corrige les lésions de l’ADN induites par les UV ainsi que par de nombreuses molécules utilisées en chimiothérapie. Nous nous intéressons au facteur TFIIH, un acteur majeur de cette voie multi-protéique composé de 10 sous-unités parmi lesquelles la translocase XPB, l’hélicase XPD et la kinase Cdk7. XPD contribue à vérifier la présence d’une lésion et catalyse l’ouverture de la double hélice d’ADN au niveau de la lésion afin de permettre l’excision du brin endommagé. TFIIH est impliqué non seulement dans la voie NER mais également dans l’initiation de la transcription et sa régulation. Des mutations dans 3 de ses sous-unités sont à l’origine de plusieurs maladies génétiques rares et constituent une cible thérapeutique emergente pour le traitement de plusieurs cancers.


Projet : Le stage proposé se focalisera sur l’étude de la dynamique du facteur transcription/réparation TFIIH dans un contexte cellulaire. Il est clairement établi que la forme active en transcription est composée du cœur-TFIIH associé au complexe kinase (CAK), et que le module kinase se dissocie du cœur lorsque TFIIH participe à la réparation de l'ADN. Les techniques récentes d’ingénierie du génome nous ont permis d’obtenir des lignées cellulaires exprimant des sous-unités de TFIIH étiquetées avec des protéines fluorescentes. Ces lignées seront utilisées pour caractériser la composition et la dynamique de TFIIH en conditions normales, en réponse à des dommages à l'ADN et/ou suite à l’action de molécules inhibitrices de la transcription ou la réparation: (i) Analyse de la composition de TFIIH et de ses partenaires basées sur des expériences de GFP-trap/MS, (ii) Utilisation de microscopie à super résolution pour les expériences de co-localisation. (iii) Imagerie de cellules vivantes pour visualiser l'engagement cinétique de XPB, XPD et CAK en réponse à des dommages à l'ADN.

Techniques: Techniques de biologie moléculaire (extraction d’ADN, PCR,..), culture cellulaire et caractérisation biochimique (préparation d’extrait cellulaires, analyse par SDS page et WB) et imagerie (microscopie à fluorescence sur cellules fixées et en cellules vivantes, microscopie de super résolution, analyse d’image – Fidji -).