Stage Master

FR

Contexte:
Les mutations de l'ADN mitochondrial sont une source importante de maladies neurodégénératives et métaboliques pour la plupart incurables. Ces mutations sont pour la plupart hétéroplasmiques, c’est-à-dire présentes simultanément avec l'ADN sain dans les mêmes cellules. Changer le taux d'ADN mitochondrial mutant serait une stratégie intéressante de thérapie génique. Plusieurs approches expérimentales ont été récemment développées pour modifier (éliminer ou éditer) l'ADN mitochondrial, mais la méthodologie la plus flexible et applicable à tout autre type de génome, le système CRISPR-Cas, n'a pas encore été appliqué avec succès aux mitochondries. Le laboratoire d'accueil vise à développer un tel système, en utilisant une nouvelle approche qui peut permettre la création de nouvelles molécules thérapeutiques (complexes RNP) contre les maladies mitochondriales.

Objectifs:
Le projet M2 consistera à adapter un système récemment décrit (Ling et al., Mol Cell 2021) pour créer un lien covalent entre la nucléase AsCas12a et l'ARN guide. En se basant sur le savoir-faire de l'équipe dans le domaine de recherche sur les mitochondries (https://mito.unistra.fr/publications/toutes-les-publications) et les résultats récents sur la possibilité de simplifier les ARN-guide (Shebanova et al., NAR 2021), les conjugats entre nuclease Cas12a et les ARNg seront construits et testés in vitro (dans les mitochondries humaines isolées) et ex-vivo (dans les lignées de cellules immortalisées portant des mutations pathogéniques dans l'ADN mitochondrial) pour leur capacités à induire des clivages spécifiques de molécules d'ADNmt mutantes.

Méthodes:
Clonage moléculaire; mutagénèse dirigée; culture cellulaire; transfection bactérienne et de cellules humaines; click-chemistry; isolement d'ARN et d'ADN mitochondriaux; analyse des taux de mutation par RLFP; analyse de produit de clivage par LM-PCR et NGS.

Publications de l'équipe en relation avec le projet:
1 Shebanova, R. et al. Efficient target cleavage by Type V Cas12a effectors programmed with split CRISPR RNA. Nucleic acids research, doi:10.1093/nar/gkab1227 (2021).
2 Meschaninova, M. I., Entelis, N. S., Chernolovskaya, E. L. & Venyaminova, A. G. A Versatile Solid-Phase Approach to the Synthesis of Oligonucleotide Conjugates with Biodegradable Hydrazone Linker. Molecules 26, doi:10.3390/molecules26082119 (2021).
3 Dovydenko, I. et al. Lipophilic Conjugates for Carrier-Free Delivery of RNA Importable into Human Mitochondria. Methods in molecular biology 2277, 49-67, doi:10.1007/978-1-0716-1270-5_4 (2021).
4 Jeandard, D. et al. Import of Non-Coding RNAs into Human Mitochondria: A Critical Review and Emerging Approaches. Cells 8, doi:10.3390/cells8030286 (2019).
5 Loutre, R., Heckel, A. M., Smirnova, A., Entelis, N. & Tarassov, I. Can Mitochondrial DNA be CRISPRized: Pro and Contra. IUBMB life 70, 1233-1239, doi:10.1002/iub.1919 (2018).

EN

Background:
Mitochondrial DNA mutations are a major source of currently incurable neurodegenerative and metabolic diseases. These mutations are mostly heteroplasmic, i.e. present simultaneously with healthy DNA in the same cells. Changing the level of mutant mitochondrial DNA would be an interesting gene therapy strategy. Several experimental approaches have recently been developed to modify (remove or edit) mitochondrial DNA, but the most flexible methodology applicable to any other genome type, the CRISPR-Cas system, has not yet been successfully applied to mitochondria. The host lab aims to develop such a system, using a new approach which can allow the creation of therapeutic molecules (RNP complexes) against mitochondrial diseases.

Objectives:
The M2 project will adapt a recently described system (Ling et al., Mol Cell 2021) to create a covalent link between the AsCas12a nuclease and the guide RNA. Based on the team's expertise in mitochondrial research (https://mito.unistra.fr/publications/toutes-les-publications) and recent results on the possibility of simplifying guide RNAs (Shebanova et al, NAR 2021), conjugates between the Cas12a enzyme and gRNAs will be constructed and tested in vitro (in isolated human mitochondria) and ex vivo (in immortalized cell lines carrying pathogenic mutations in mitochondrial DNA) for their ability to induce specific cleavages of mutant mtDNA molecules.

Methods :
Molecular cloning; site-directed mutagenesis; cell culture; bacterial and human cell transfection; click-chemistry; mitochondrial RNA and DNA isolation; mutation rate analysis by RLFP; cleavage product analysis by LM-PCR and NGS.

Publications of the team related to the project:
1 Shebanova, R. et al. Efficient target cleavage by Type V Cas12a effectors programmed with split CRISPR RNA. Nucleic acids research, doi:10.1093/nar/gkab1227 (2021).
2 Meschaninova, M. I., Entelis, N. S., Chernolovskaya, E. L. & Venyaminova, A. G. A Versatile Solid-Phase Approach to the Synthesis of Oligonucleotide Conjugates with Biodegradable Hydrazone Linker. Molecules 26, doi:10.3390/molecules26082119 (2021).
3 Dovydenko, I. et al. Lipophilic Conjugates for Carrier-Free Delivery of RNA Importable into Human Mitochondria. Methods in molecular biology 2277, 49-67, doi:10.1007/978-1-0716-1270-5_4 (2021).
4 Jeandard, D. et al. Import of Non-Coding RNAs into Human Mitochondria: A Critical Review and Emerging Approaches. Cells 8, doi:10.3390/cells8030286 (2019).
5 Loutre, R., Heckel, A. M., Smirnova, A., Entelis, N. & Tarassov, I. Can Mitochondrial DNA be CRISPRized: Pro and Contra. IUBMB life 70, 1233-1239, doi:10.1002/iub.1919 (2018).